發(fā)布日期：2019-07-16

數(shù)字PCR簡(jiǎn)介

　　數(shù)字PCR（Digtal PCR）是一種核酸定量精密檢測(cè)的新興技術(shù)手段，于20世紀(jì)由Vogelstein等提出。它是將稀釋后的核酸模板分配到大量不同的反應(yīng)單元中，使每個(gè)反應(yīng)單元中有一個(gè)或沒(méi)有核酸。利用PCR擴(kuò)增的同時(shí)，加入可檢測(cè)熒光。待擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采集每個(gè)反應(yīng)單元出現(xiàn)的熒光次數(shù)，從而定量檢測(cè)樣本中的核酸濃度。

　　基于分液方式的不同，數(shù)字PCR主要分為3種：微流體數(shù)字PCR(Microfluidic digital PCR，mdPCR)、微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)和芯片數(shù)字PCR(Chip digital PCR，cdPCR)。

數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)

　　相對(duì)于二代測(cè)序、基因芯片和定量PCR而言，數(shù)字PCR具備以下優(yōu)勢(shì):

　　· 靈敏度可達(dá)到單個(gè)核酸分子：檢測(cè)限低至0.001%，主要系為數(shù)字PCR可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)DNA/RNA的生物濃縮；

　　· 無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線活參照基因進(jìn)行對(duì)比來(lái)測(cè)定核算量，可對(duì)靶分子起始量進(jìn)行絕對(duì)定量，直接獨(dú)處DNA分子的個(gè)數(shù)；

　　· 適合環(huán)境復(fù)雜樣品的檢測(cè)：終點(diǎn)PCR檢測(cè)，不依賴Ct值，不依賴擴(kuò)增效率，能克服PCR抑制劑的影響，避免樣品間的交叉感染問(wèn)題，適合各類(lèi)復(fù)雜環(huán)境中的樣本進(jìn)行絕對(duì)定量，如動(dòng)血樣、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等；

　　· 能夠有效區(qū)分濃度差異微小的樣品：更好的準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性，可以用于精確測(cè)定靶基因的相對(duì)表達(dá)，基因拷貝數(shù)變異分析等。

　　· 數(shù)字PCR可開(kāi)發(fā)針對(duì)不同癌癥、不同樣本以及不同的樣本環(huán)境提供檢測(cè)解決方案，該技術(shù)的應(yīng)用范圍廣泛，尤其在液體活檢領(lǐng)域，已開(kāi)發(fā)針對(duì)肺癌、乳腺癌、腸癌、胃癌等上百個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，可精準(zhǔn)指導(dǎo)臨床治療的診斷，以便患者在后續(xù)得到更及時(shí)并且適當(dāng)?shù)闹委煼桨柑峁?/p>

數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用

　　隨著美國(guó)FDA批準(zhǔn)了一款用于白血病BCR-ABL融合基因檢測(cè)的數(shù)字PCR試劑盒，標(biāo)志了這一技術(shù)正式走向廣闊的臨床應(yīng)用市場(chǎng)。我國(guó)的分子診斷市場(chǎng)正處于快速發(fā)展階段，預(yù)計(jì)2021年可以達(dá)到100億以上的規(guī)模，而數(shù)字PCR將成為這一市場(chǎng)高速增長(zhǎng)的重要驅(qū)動(dòng)力。

　　數(shù)字PCR技術(shù)可廣泛應(yīng)用于腫瘤液體活檢、靶向治療伴隨診斷、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)、病原微生物（病毒、細(xì)菌、真菌等）檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、遺傳疾病診斷、移植排斥監(jiān)控、腸道菌群分析、藥物基因組檢測(cè)、基因表達(dá)分析、環(huán)境檢測(cè)和分子生態(tài)、農(nóng)業(yè)和動(dòng)植物檢測(cè)等多個(gè)研究方向。以下簡(jiǎn)要介紹其中幾種。

　　1. 腫瘤的早期研究

　　循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是活腫瘤細(xì)胞釋放的DNA，半衰期約為1.5h。對(duì)循環(huán)腫瘤DNA進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測(cè)分析，不僅有利于早期發(fā)現(xiàn)癌癥，還能監(jiān)測(cè)癌癥復(fù)發(fā)情況，這對(duì)癌癥患者的發(fā)病率和死亡率產(chǎn)生重大影響。與腫瘤組織活檢相比，血液循環(huán)腫瘤DNA分析具有微創(chuàng)性，可以定期隨訪癌癥患者監(jiān)測(cè)癌癥。然而，使用ctDNA進(jìn)行早期癌癥診斷也并不容易，因?yàn)檠褐写嬖诘哪[瘤DNA的量較少，并且腫瘤DNA會(huì)被源自非腫瘤細(xì)胞的DNA稀釋?；谝旱蔚臄?shù)字PCR等新技術(shù)的開(kāi)發(fā)大大提高了檢測(cè)稀有序列的靈敏度、特異性和精確度，為癌癥的早期研究和診斷奠定基礎(chǔ)。

　　2. 腫瘤治療的伴隨診斷

　　常用體液來(lái)源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來(lái)源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過(guò)微液滴處理能在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物的有效檢測(cè)，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測(cè)、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)等，應(yīng)用于腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。

　　3.無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查

　　現(xiàn)有的遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷方法大都需要通過(guò)羊膜穿刺、絨毛取樣等侵入性技術(shù)從母體子宮內(nèi)得到胎兒樣本(細(xì)胞、排泄物等) 再進(jìn)行遺傳學(xué)分析。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展與完善，無(wú)論是準(zhǔn)確度和安全性都已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)界的公認(rèn)，但仍存在一定程度的胎兒流產(chǎn)和死胎的可能性。

　　基于母體血液分析的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前遺傳疾病篩查是如今的研究熱潮。如21號(hào)染色體為3倍體的唐氏綜合征、已知父母基因型的胎兒地貧檢測(cè)或已知父母基因型的其它核酸病檢測(cè)（孟德?tīng)栂嚓P(guān)遺傳疾?。Ｓ捎谀壳皹?biāo)本來(lái)源主要為血液，而待檢測(cè)的胎兒DNA受到母體DNA的干擾，因此檢測(cè)的準(zhǔn)確性受到影響。基于獨(dú)特的微滴化數(shù)字PCR技術(shù)，可作為二代測(cè)序法的補(bǔ)充進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，從而提高準(zhǔn)確度及分辨率。因此，數(shù)字PCR技術(shù)在遺傳學(xué)產(chǎn)前檢查中具有廣泛的應(yīng)用前景。

　　4.病原微生物的檢測(cè)

　　疾病預(yù)防控制中心、出入境檢驗(yàn)檢疫局系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室，采用數(shù)字PCR技術(shù)了可滿足該類(lèi)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復(fù)性更好、無(wú)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對(duì)定量結(jié)果，同時(shí)操作簡(jiǎn)便。

　　對(duì)于研究類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)室，可利用dPCR靈敏度高的特點(diǎn)，對(duì)各種樣品中的病原微生物進(jìn)行研究。如HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過(guò)程中病毒殘留量的監(jiān)控；HBV耐藥突變的檢測(cè)；HCV的分子分型；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內(nèi)感染監(jiān)控；環(huán)境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等。

　　5. 甲基化含量鑒定

　　作為表觀遺傳學(xué)研究中重要的一個(gè)研究方向——甲基化程度分析，現(xiàn)階段有不同的方法或技術(shù)來(lái)進(jìn)行研究：如傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測(cè)序統(tǒng)計(jì)法、抗體檢測(cè)法、定量PCR檢測(cè)法等。這些方法皆因方法學(xué)的問(wèn)題而不能獲得精確的定量，而微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)通過(guò)對(duì)樣品的微滴化處理及目標(biāo)因子的絕對(duì)拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的精確定量檢測(cè)提供了一種全新的技術(shù)。

　　6.拷貝數(shù)分析

　　基因拷貝數(shù)變異（Copy number variations，CNVs）是指人類(lèi)基因組中存在的，較之于參照基因組DNA片段缺失或復(fù)制大于1kb到Mb的亞微觀結(jié)構(gòu)變異，CNVs本身蘊(yùn)含著豐富的遺傳信息，對(duì)于研究基因變異在生物進(jìn)化及疾病進(jìn)程等領(lǐng)域具有重要意義。相較于現(xiàn)有的CNVs研究技術(shù)（定量PCR、高密度寡核苷酸芯片high density oligo nucleotide array，F(xiàn)ISH，比較基因組芯片microarray based comparative genomic hybridization，array-CGH，測(cè)序等），dPCR在靈敏度和分辨率方面更具優(yōu)勢(shì)，尤其適用于更高拷貝數(shù)分析，確定確切的拷貝數(shù)，檢測(cè)精度超過(guò)±10%。

數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)跑者

　　國(guó)際上，ABI（Applied Biosystems）和Bio-Rad是數(shù)字PCR儀器領(lǐng)域的兩大巨頭。

　　· ABI（Applied Biosystems）：ABI的dPCR儀器為QuantStudio 3D，采用芯片式分液技術(shù)，操作流程全自動(dòng)；

　　· Bio-Rad：Bio-Rad的dPCR儀器包括QX200和RainDrop，均采用液體式分液技術(shù)，操作流程均半自動(dòng)。在價(jià)格上，RainDrop優(yōu)于QX200和QuantStudio3D。

　　另外，基因行業(yè)巨頭例如Illumina、Roche（羅氏）、ThermoFisher（賽默飛）、Qiagen（凱杰）等均已布局?jǐn)?shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)域，極大地推動(dòng)了該領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

　　國(guó)內(nèi)企業(yè)包括泛生子、永諾生物、科維思、諾禾致源、小海龜科技、領(lǐng)航基因、新羿生物、愛(ài)普拜、銳訊生物均已進(jìn)軍數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)域。（對(duì)于布局?jǐn)?shù)字PCR技術(shù)的公司，如有遺漏，歡迎大家在評(píng)論區(qū)進(jìn)行補(bǔ)充哦。）

　　總而言之，數(shù)字PCR技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，在遺傳病、病原體、癌基因檢測(cè)等分子診斷領(lǐng)域等領(lǐng)域發(fā)揮了不可替代的作用?？梢灶A(yù)見(jiàn)，它將繼續(xù)引領(lǐng)分子診斷熱潮，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

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