發(fā)布日期：2019-05-30

　　迄今為止最大的合成基因組誕生了，這個(gè)只有部分氨基酸編碼密碼子的基因組讓未來(lái)編碼出含有非天然氨基酸殘基的蛋白成為了可能。

　　過(guò)去十年來(lái)，隨著DNA化學(xué)合成的成本不斷降低，DNA片段的組裝方式日益精進(jìn)，合成生物學(xué)邁入了合成整個(gè)染色體和基因組的新階段。迄今為止，研究人員可以用最多100萬(wàn)堿基對(duì)構(gòu)建出合成DNA，比如之前釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）的一組染色體以及絲狀支原體（Mycoplasma mycoides）的各種合成基因組。如今，F(xiàn)redens等人在《自然》上發(fā)表論文稱(chēng)，團(tuán)隊(duì)合成了一個(gè)有400萬(wàn)堿基對(duì)的大腸桿菌（Escherichia coli）基因組。該研究是合成基因組學(xué)這一新興領(lǐng)域內(nèi)具有里程碑意義的事件，也是合成基因組技術(shù)在這個(gè)“勞苦功高”的細(xì)菌上的首次應(yīng)用。

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　　合成基因組學(xué)賦予了我們認(rèn)識(shí)生命規(guī)則的全新方式，同時(shí)也在推動(dòng)合成生物學(xué)朝著基因組編寫(xiě)設(shè)計(jì)的方向前進(jìn)。這一領(lǐng)域的先驅(qū)是來(lái)自美國(guó)克雷格·文特爾研究所（J。 Craig Venter Institute）的研究人員，為了確定獨(dú)立生存細(xì)胞所需的最少基因數(shù)量，他們選擇通過(guò)這種方法先讓計(jì)算機(jī)對(duì)基因組片段進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，再化學(xué)合成這些片段，最后完成組裝。憑借這一技術(shù)，這些研究人員成功地將絲狀支原體的基因組大小縮減了約50%。如果換用基因組編輯工具則會(huì)大大增加工作量，以往的大腸桿菌實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了這一點(diǎn)——基因刪除方法最多只能去除15%的基因組。

　　Fredens和同事將縮小后的大腸桿菌基因組作為一個(gè)合成基因組模板，但他們腦中還有另一種最小化的辦法——縮減密碼子。遺傳密碼本身具有冗余性：一共有64個(gè)密碼子（堿基三聯(lián)體）編碼20種氨基酸，以及代表一段蛋白編碼序列啟動(dòng)和終止的“起始”點(diǎn)和“終止”點(diǎn)。這種冗余意味著有6個(gè)編碼絲氨酸的密碼子和3個(gè)可能的終止密碼子。大腸桿菌的蛋白編碼序列有64個(gè)可用密碼子，F(xiàn)redens等人通過(guò)設(shè)計(jì)、合成和組裝，只用61個(gè)密碼子就構(gòu)建出了大腸桿菌基因組，他們的做法是將兩個(gè)絲氨酸密碼子和一個(gè)終止密碼子用同義密碼子替代——同義密碼子是指“拼寫(xiě)”不同但發(fā)出指令相同的密碼子。之前使用基因組編輯工具的研究成功用63個(gè)密碼子合成了一個(gè)大腸桿菌，但這只需要將序列為T(mén)AG的終止密碼子（基因組中有321個(gè)）替換成另一個(gè)終止密碼子。而這次縮減至61個(gè)密碼子則需要改變18214個(gè)密碼子，為此必須采用基因組合成的方法。

　　Fredens和同事通過(guò)之前為研究大腸桿菌密碼子縮減極限而開(kāi)發(fā)的大規(guī)模DNA組裝和基因組整合方法，合成了這個(gè)大腸桿菌基因組。他們先在計(jì)算機(jī)上對(duì)DNA進(jìn)行設(shè)計(jì)，再在釀酒酵母載體中化學(xué)合成并組裝100千堿基片段，這些載體隨即被大腸桿菌攝取，并直接整合到基因組中對(duì)應(yīng)的天然區(qū)域（見(jiàn)圖1）。將這個(gè)過(guò)程迭代5次，就能讓500千堿基的DNA節(jié)段完全被合成DNA取代。研究團(tuán)隊(duì)用這種方法生成了8個(gè)大腸桿菌菌株，每個(gè)菌株都攜帶有覆蓋不同基因組區(qū)域的合成DNA節(jié)段。隨后，研究人員再通過(guò)“接合”的方法將這些節(jié)段拼湊起來(lái)，合成完整的基因組。

圖1|重編碼基因組的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。a.Fredens等人對(duì)大腸桿菌基因組的3個(gè)堿基三聯(lián)體（密碼子）進(jìn)行了重編寫(xiě)，將編碼絲氨酸的TCG和TCA和代表蛋白編碼序列終止的終止密碼子TAG替換成具有相同功能的密碼子AGC、AGT和TAA。

　　b、在基因組的某些位點(diǎn)上，開(kāi)放讀碼框（ORF，即蛋白編碼區(qū)域）會(huì)發(fā)生重疊，對(duì)某個(gè)ORF密碼子做出改變可能會(huì)導(dǎo)致重疊區(qū)域出現(xiàn)非預(yù)期的變化。Fredens等人通過(guò)“重構(gòu)”這些ORF使其分離，如圖中的ORF1和ORF2（左邊兩個(gè)ORF的“讀取”方向相同，右邊兩個(gè)讀取方向相反）。

　　c、經(jīng)過(guò)重新設(shè)計(jì)的DNA可以在釀酒酵母中合成組裝100千堿基片段；這些片段再組合成節(jié)段，整合到大腸桿菌的基因組中。將這些節(jié)段結(jié)合就能獲得完整的功能合成基因組。

　　這一大規(guī)模的構(gòu)建工程取得了驚人的成功，脫靶突變率很低，但也存在一些挑戰(zhàn)。大腸桿菌基因組中的許多基因會(huì)與其它基因有部分重疊，研究人員發(fā)現(xiàn)有91個(gè)存在重疊區(qū)域含有需要改變的密碼子的情況。這很復(fù)雜，因?yàn)橐粋€(gè)蛋白編碼序列中的同義替換可能會(huì)使重疊序列編碼的氨基酸發(fā)生改變。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)基因組中的79個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了“重構(gòu)”，通過(guò)復(fù)制這段序列，他們將重疊的編碼序列分開(kāi)，變成單個(gè)重編碼序列（見(jiàn)圖1）。雖然這一方法基本上很成功， 但有些地方需要非常小心的錯(cuò)誤排查，因?yàn)橹貥?gòu)可能改變了基因調(diào)控。

　　最后得到的菌株被證實(shí)可以存活，并能在各種典型的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下生長(zhǎng)，但是比天然菌株長(zhǎng)得稍慢一些。新的菌株不再需要終止密碼子TAG以及絲氨酸密碼子TCG和TCA，因此，識(shí)別這些密碼子的細(xì)胞機(jī)器也可以被去除或重新用于招募“非標(biāo)準(zhǔn)”氨基酸——大部分活細(xì)胞所需的20種常見(jiàn)氨基酸之外的氨基酸。研究人員用只有63個(gè)密碼子的大腸桿菌證實(shí)了招募非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的用處。對(duì)于生物技術(shù)項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以被寫(xiě)入理想的序列位置，提供可以參與天然蛋白無(wú)法參與的化學(xué)反應(yīng)的殘基。不僅如此，由于支持合成大腸桿菌細(xì)胞運(yùn)作的遺傳密碼稍不同于自然世界中的其它細(xì)胞，輸入和輸出合成大腸桿菌的可讀取DNA編碼信息將變得有限，并因此帶來(lái)了生物安全方面的益處。以上種種應(yīng)用都會(huì)在新的61個(gè)密碼子的大腸桿菌中得到進(jìn)一步拓展，新菌株有潛力編碼不止一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的使用，并建立一個(gè)更嚴(yán)苛的基因防火墻（因?yàn)?4個(gè)密碼子中的3個(gè)密碼子已不再被識(shí)別）。

　　合成400萬(wàn)堿基對(duì)的基因組，以及將遺傳密碼縮減至61個(gè)密碼子創(chuàng)造了合成基因組學(xué)的最新紀(jì)錄，但這個(gè)紀(jì)錄可能不會(huì)保持得太久。國(guó)際Sc2.0聯(lián)盟正在設(shè)法合成有1200萬(wàn)堿基對(duì)的釀酒酵母基因組的全部16個(gè)染色體，這也是首個(gè)真核生物（包括植物、動(dòng)物和真菌）的合成基因組。同時(shí)，聯(lián)盟還在嘗試合成只有57個(gè)密碼子的大腸桿菌基因組以及比天然鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella Typhimurium）少兩個(gè)密碼子的合成基因組。如果成功，將來(lái)?yè)碛泻铣苫蚪M的細(xì)菌有望作為基于細(xì)胞的技術(shù)，應(yīng)用于人體腸道。

　　從純技術(shù)的角度來(lái)說(shuō)，這些不同的研究最值得關(guān)注的點(diǎn)在于它們構(gòu)建合成基因組的流程極為相似，都是將合成DNA的千堿基節(jié)段（通過(guò)同源重組）在酵母細(xì)胞中組裝成 50-100千堿基片段，再用這些片段（通過(guò)選擇重組的方法）替代目標(biāo)生物體中的天然序列。方法的標(biāo)準(zhǔn)化有利于實(shí)現(xiàn)部分步驟的自動(dòng)化，讓更多團(tuán)隊(duì)加入研究行列?；蚪M最小化和密碼子縮減只是這一技術(shù)的初步應(yīng)用，今后，這種技術(shù)或能生成功能重組基因組，或者能指示細(xì)胞執(zhí)行特定任務(wù)的“定制”基因組。

來(lái)源：Nature自然科研