發(fā)布日期：2018-07-13

　　2017年，Kymriah與Yescarta的獲批上市宣告了CAR-T療法時(shí)代的到來(lái)，也讓我們看到了基因編輯與細(xì)胞療法的無(wú)限潛力。昨日，一篇發(fā)表在《自然》期刊上的研究，則有望進(jìn)一步加快細(xì)胞療法的研發(fā)進(jìn)程。業(yè)內(nèi)諸多專家們表示，這可能會(huì)給細(xì)胞療法領(lǐng)域帶來(lái)重大變革。

　　病毒載體的應(yīng)用和瓶頸

　　目前上市的兩款CAR-T療法，其使用的基因編輯技術(shù)均依賴于病毒載體。這是對(duì)病毒的一次成功改造——很久以前我們就知道，病毒的遺傳物質(zhì)能穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，引起感染。這個(gè)特性引起了科學(xué)家們的興趣。在1970年代，“生物黑客”們移除了病毒中的致病部分，將它們改造成了遞送遺傳物質(zhì)的工具。“病毒載體”一詞也由此誕生。如今，這些病毒在基因療法和細(xì)胞療法中得到了廣泛的應(yīng)用。

▲目前獲批的CAR-T療法，使用的都是基于病毒載體的編輯技術(shù)（圖片來(lái)源：諾華官方網(wǎng)站）

　　盡管基于病毒載體的先進(jìn)療法在研發(fā)上取得了諸多突破和進(jìn)展，也讓我們看到了創(chuàng)新基因療法和細(xì)胞療法井噴的希望，但病毒載體本身卻有著成本高、周期長(zhǎng)的瓶頸。此外，單靠病毒載體也無(wú)法將基因精準(zhǔn)地插入到所需的位置，能帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)——它們可能會(huì)影響到健康基因的表達(dá)，或是導(dǎo)致插入基因被異常調(diào)節(jié)，出現(xiàn)失控。這些風(fēng)險(xiǎn)都是高懸于病毒載體頭上的達(dá)克摩利斯之劍，使我們?cè)诨虔煼ê图?xì)胞療法的研發(fā)上不得不慎之又慎。

　　“人們花了30年的時(shí)間，想要把基因轉(zhuǎn)入到T細(xì)胞中。”該研究的第一作者，正在攻讀MD/PhD學(xué)位的Theo Roth說(shuō)道。他指出，為了開發(fā)用于T細(xì)胞編輯的病毒載體，即便有6-7名科學(xué)家辛勤工作，也要花上約數(shù)月，甚至是一年來(lái)進(jìn)行開發(fā)。如果能找到一種不使用病毒載體，但依然能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效編輯的方法，無(wú)疑將極大地加速先進(jìn)療法的開發(fā)。這對(duì)整個(gè)領(lǐng)域而言，可能帶來(lái)革命性的變化。

▲本研究的第一作者Theo Roth（圖片來(lái)源：UCSF）

　　而本篇《自然》上公布的方法看起來(lái)簡(jiǎn)單得不可思議：誰(shuí)也沒有想到，幾十年前就在微生物研究中大放異彩的電穿孔技術(shù)（electroporation），竟能在細(xì)胞療法的開發(fā)上煥發(fā)光彩。

　　“海格力斯的試煉”

　　許多看似簡(jiǎn)單的成果背后，往往有著常人難以想象的枯燥工作，這項(xiàng)研究也不例外。盡管在幾十年前，我們就在微生物中嘗試了電穿孔方法來(lái)引入外源DNA，但這種方法先前尚未在細(xì)胞療法里得到廣泛應(yīng)用，不是沒有原因的。

　　在電穿孔技術(shù)中，研究人員們會(huì)給細(xì)胞施加一個(gè)電場(chǎng)，瞬間增加細(xì)胞膜的通透性，讓雙鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞。但在T細(xì)胞內(nèi)，一旦引入較長(zhǎng)的雙鏈DNA片段，竟會(huì)導(dǎo)致這些細(xì)胞的死亡。在經(jīng)過(guò)大量的嘗試后，許多科學(xué)家們都放棄了這個(gè)挑戰(zhàn)。他們認(rèn)為，較長(zhǎng)的雙鏈DNA會(huì)對(duì)T細(xì)胞產(chǎn)生毒性。相比之下，引入單鏈寡核苷酸則更具可行性。

　　但Theo則不信這個(gè)邪。從之前的一些研究結(jié)果中，他敏銳地觀察到，如果在電穿孔技術(shù)中同時(shí)應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)與雙鏈DNA模板，就有望能減少雙鏈DNA相關(guān)的細(xì)胞毒性。這給他的研究帶來(lái)了突破口，也帶來(lái)了更多的問(wèn)題：CRISPR和DNA的最佳比例是多少？DNA的質(zhì)量需要多高？這些T細(xì)胞需要特殊培養(yǎng)嗎？電穿孔所使用的電流強(qiáng)度是多少？只有各個(gè)條件都得到了優(yōu)化，我們才能有效地使用這種簡(jiǎn)便的方法，去改造T細(xì)胞。

▲數(shù)千次的失敗，才帶來(lái)了這套完善的改造流程（圖片來(lái)源：《自然》）

　　除了挨個(gè)嘗試之外，Theo沒有其他選擇。

　　該研究的負(fù)責(zé)人Alexander Marson教授認(rèn)為，Theo的堅(jiān)守對(duì)成功至關(guān)重要。盡管主流學(xué)界都相信T細(xì)胞只能耐受小片段的DNA，都相信病毒載體不可或缺，但Theo不懼權(quán)威，“展現(xiàn)出了海格力斯般的努力，測(cè)試了數(shù)千種不同的條件”。

▲利用這套系統(tǒng)，研究人員們可以“隨心所欲”地將綠色熒光蛋白表達(dá)于細(xì)胞的不同部位（圖片來(lái)源：《自然》）

　　成功建立在數(shù)千次失敗之上。經(jīng)過(guò)近一年的反復(fù)嘗試，Theo終于總結(jié)出了一套行之有效的方法，并成功證明這套不使用病毒載體的系統(tǒng)，能成功對(duì)基因組進(jìn)行高效編輯。在概念驗(yàn)證性的實(shí)驗(yàn)中，這支團(tuán)隊(duì)成功讓綠色熒光蛋白按照需求，在細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、以及細(xì)胞器中特異表達(dá)。

　　更令人印象深刻的是，這套系統(tǒng)能將原來(lái)需要花費(fèi)數(shù)月甚至數(shù)年的工作，縮短到僅僅幾周！

　　臨床應(yīng)用的曙光

　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證這套系統(tǒng)的潛力，研究人員們又做了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，他們從罹患罕見自身免疫疾病的患者中取得了T細(xì)胞。基因組測(cè)序結(jié)果表明，這些T細(xì)胞的IL2RA基因帶有突變，讓它無(wú)法行使正常功能。因此，患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)發(fā)育異常，無(wú)法有效地控制免疫系統(tǒng)，從而讓它對(duì)自身展開攻擊。

　　利用他們開發(fā)的新型技術(shù)，這群科學(xué)家們快速地修復(fù)了T細(xì)胞中的IL2RA基因缺陷，重塑關(guān)鍵的細(xì)胞通路。出于安全性上的考慮，研究人員們沒有將經(jīng)改造的細(xì)胞輸注回患者體內(nèi)。但類似于CAR-T療法，未來(lái)，我們有望在體外修正患者的T細(xì)胞，并在擴(kuò)增之后，重新輸注給患者，治療他們的自身免疫疾病。

▲經(jīng)過(guò)這套系統(tǒng)改造的T細(xì)胞能特異性聚集在腫瘤附近，且與病毒載體改造的細(xì)胞有類似的效率（圖片來(lái)源：《自然》）

　　在第二項(xiàng)研究中，科學(xué)家們則把目光投向了癌癥的治療。他們從健康人體內(nèi)獲取了T細(xì)胞，并更換了它們的T細(xì)胞受體，使這些細(xì)胞能特異性地攻擊某種人類的黑色素瘤細(xì)胞。在培養(yǎng)皿中，這些T細(xì)胞能有效地靶向黑色素瘤細(xì)胞，而不會(huì)識(shí)別其他類型的細(xì)胞，表明了其特異性。而在小鼠的腫瘤模型里，這些具有全新受體的T細(xì)胞也同樣能聚集在腫瘤位點(diǎn)，展現(xiàn)出抗癌的活性。

　　“這是一種快速、靈活的方法，能對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行改造、增強(qiáng)、以及重編程，使我們能賦予這些細(xì)胞各種特異性，用來(lái)摧毀腫瘤，識(shí)別感染，或是減少它們的免疫反應(yīng)，治療自身免疫疾病，” Marson教授補(bǔ)充道：“現(xiàn)在，我們參與到了所有的前沿領(lǐng)域中。”

　　這項(xiàng)成本更低，且能在短短數(shù)周內(nèi)完成自定義T細(xì)胞改造的方法，得到了許多業(yè)內(nèi)專家的看好。如果它能在細(xì)胞療法的開發(fā)上得到更多應(yīng)用，無(wú)疑將有潛力改變當(dāng)下的研發(fā)格局。近期，美國(guó)FDA出臺(tái)了一系列針對(duì)基因療法和細(xì)胞療法的政策，鼓勵(lì)這些先進(jìn)療法的研發(fā)。我們期待在這個(gè)激勵(lì)創(chuàng)新的大環(huán)境下，更多突破性的技術(shù)能得到轉(zhuǎn)化，為全球患者帶來(lái)更多有效療法。

　　參考資料：

　　[1] Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting

　　[2] T cell engineering breakthrough sidesteps need for viruses in gene-editing

　　[3] Electroporation – 維基百科

　　[4] Parker Institute scientists herald a cell therapy breakthrough in the lab, using next-gen CRISPR tech to engineer T cells

　　[5] Virus-free CRISPR could mean faster, more precise gene editing for T-cell therapies

　　原標(biāo)題：Nature重磅：細(xì)胞療法將迎重大變革？新技術(shù)可將基因編輯縮短至幾周

來(lái)源：藥明康德