發(fā)布日期：2018-03-22

　　基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，到現(xiàn)在已發(fā)展到第三代基因編輯技術(shù)。第三代基因技術(shù)CRISPR/Cas克服了傳統(tǒng)基因操作的周期長、效率低、應(yīng)用窄等缺點。作為一種最新涌現(xiàn)的基因組編輯工具，CRISPR/Cas能夠完成RNA導向的DNA識別以及編輯。通過一段序列特異性向?qū)NA分子（sequence-specific guide RNA）引導核酸內(nèi)切酶到靶序列處，從而完成基因組的精確編輯，因其操作簡單、成本低、高效率，近幾年成為炙手可熱的基因編輯手段，目前已廣泛用于模式生物研究，醫(yī)療，植物作物，農(nóng)業(yè)畜牧等領(lǐng)域。

　　1、磨快CRISPR利器，加快科學發(fā)現(xiàn)

　　CRISPR/Cas9的出現(xiàn)給了科研人員無限想象的可能，基于CRISPR/Cas9的技術(shù)很快就被廣泛應(yīng)用于全世界各個實驗室中，這里我們將主要介紹最常用的幾種應(yīng)用。

　　早期，科研人員通過同源重組（HR）介導的基因打靶技術(shù)來實現(xiàn)基因編輯，但因效率太低，極大地限制了其應(yīng)用。為了克服這一難題，一系列通過核酸內(nèi)切酶介導的基因編輯技術(shù)被開發(fā)出來，通過這些核酸內(nèi)切酶切割特定的基因組序列，借助細胞自身修復體系如非同源末端連接或同源重組修復方式，并由此達到改變基因組序列的目的，鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）以及sgRNA介導的Cas9核酸內(nèi)切酶正是基于此原理工作的。

　　鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）均可通過蛋白-DNA相互作用識別基因組上的特定DNA序列并完成特定位點的切割，但是它們因效率低下、可選潛在位點少、成本高等原因極大地限制了它們的應(yīng)用，直到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)，科研人員才找到了一種成本低、效率高、簡單易用的基因編輯工具。

　　CRISPR/Cas9出現(xiàn)之后，科研人員最先想到的便是將其運用到基因編輯上了，根據(jù)目標基因的外顯子序列設(shè)計single guide RNA（sgRNA）并與含有Cas9編碼序列的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入細胞，sgRNA通過堿基互補配對的原則引導Cas9蛋白靶向目標DNA序列，Cas9蛋白會在該位點切割DNA，引發(fā)DNA雙鏈斷裂（DSB），此時細胞通過非同源末端連接修復（NHEJ）完成DNA的自身修復，因修復過程中常常發(fā)生堿基的添加和丟失，而最終導致基因的移碼突變從而達到基因敲除的目的，或者針對目的基因的上下游序列各設(shè)計一個sgRNA，從而引發(fā)該基因上下游同時發(fā)生DSB，再通過DNA損傷修復機制將斷裂的上下游兩端的DNA連接在一起，引發(fā)DNA片段缺失，從而達到基因敲除的目的。如果在此基礎(chǔ)上為細胞引入一個修復的模板質(zhì)粒，細胞就會以此模板進行同源重組修復，如果引入的修復模板是一個想要插入的基因，便可在特定的位置進行基因敲入了。

　　2、神奇的dCas9多功能工具包

　　隨著人們對Cas9研究的不斷深入，Cas9發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)也漸漸明確，在Cas9發(fā)揮切割DNA的功能時，它的兩個結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著重要作用，分別是RuvC和HNH，其中HNH結(jié)構(gòu)負責sgRNA互補鏈的切割，切割的位點位于PAM的5'端的第三個堿基外側(cè)，RuvC結(jié)構(gòu)域負責非互補鏈的切割，切割位點是在PAM上游的3-8堿基之間，當將這二者同時突變失活，便產(chǎn)生了失去DNA切割活性的Cas9蛋白了（dCas9），dCas9雖然失去了對DNA的切割能力，但依舊可以在sgRNA的引導下到達指定的DNA序列處，這是基于sgRNA–dCas9復合體的這一特征，若在dCas9上融合不同功能的結(jié)構(gòu)域，便可在特定的DNA區(qū)域完成不同的修飾了，這便形成了基于CRISPR/dCas9的工具包了。

　　腦洞大開的科學家利用dCas9蛋白，開發(fā)出各種用途的工具，可謂是把CRISPR/dCas9利用得淋漓盡致，這里我們舉幾個簡單的例子如研究人員針對目標基因的啟動子序列設(shè)計sgRNA，使得sgRNA–dCas9復合體靶向結(jié)合到目標基因的啟動子上，因dCas9蛋白帶來的空間位阻可干擾轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而引發(fā)在轉(zhuǎn)錄水平上的干擾基因表達的效果，而在此基礎(chǔ)上為了達到更佳的干擾效果，一些能夠引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄阻遏的結(jié)構(gòu)域也被融合到dCas9蛋白上，如KRAB（Krüppel-associated box）等。

　　既然可以通過CRISPR/dCas9實現(xiàn)基因表達的干擾，那是不是也可以通過CRISPR/dCas9實現(xiàn)激活基因表達呢？答案是肯定的?？蒲腥藛T通過向dCas9上融合vp64（四個串聯(lián)的vp16）、p65AD（p65 activation domain）等促進促進基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)域，實現(xiàn)基因的內(nèi)源性激活，在經(jīng)過各種優(yōu)化之后，比如由vp64、p65AD和VPR（Epstein-Barr病毒R反式激活因子Rta47）組成的三聯(lián)結(jié)構(gòu)域（dCas9–VPR）就可以實現(xiàn)很高水平的內(nèi)源性激活基因表達的效果了。

　　通過基于CRISPR/dCas9的基因表達干擾和內(nèi)源性激活工具的建立，使得科研人員在進行諸如基因功能研究的工作時有了更為簡單、高效且低成本的研究工具。這很大程度上為科研人員節(jié)約了時間和成本。

　　3、精準編輯表觀遺傳修飾

　　表觀遺傳研究是近些年來非?；馃岬念I(lǐng)域，DNA甲基化、組蛋白乙酰化等都在生物體中發(fā)揮著重要的生物學功能，而CRISPR/dCas9在表觀遺傳的研究中也成為了十分強大的工具。比如CRISPR/dCas9介導的靶向DNA甲基化修飾，我們知道在DNA甲基化過程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methytransferases，DNMTs）起著關(guān)鍵的催化作用，而且大部分DNA甲基化都發(fā)生在CpG島，因此研究人員嘗試著將DNMTs的催化結(jié)構(gòu)域融合到dCas9上形成dCas9-Dnmt3a3L，并通過sgRNA的引導靶向目標DNA序列的CpG附近催化其甲基化，以實現(xiàn)DNA甲基化的定點編輯。相似地，研究人員將在DNA去甲基化過程中起關(guān)鍵催化作用的TET1蛋白的催化結(jié)構(gòu)域融合到dCas9上形成dCas9-TET1，同樣的通過sgRNA的引導靶向目標DNA序列的CpG附近，可以實現(xiàn)去甲基化修飾。

　　再如CRISPR/dCas9介導的靶向組蛋白修飾，與靶向DNA甲基化修飾相似，一些和組蛋白修飾相關(guān)的酶包括組蛋白去甲基化酶（LSD1/KDM1A）、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶以及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等也被融合到dCas9蛋白上，以實現(xiàn)靶向組蛋白修飾。

　　除以上的應(yīng)用外，CRISPR/dCas9還被用于其他多個領(lǐng)域，比如將EGFP融合到dCas9上，通過sgRNA靶向特定DNA序列實現(xiàn)基因組成像。此外，還有研究人員開發(fā)出基于CRISPR/dCas9的enChIP技術(shù)，以來探測特定基因組區(qū)域上的DNA-蛋白質(zhì)相互作用，通過sgRNA靶向特定基因組基因座的標記dCas9的抗體免疫沉淀，之后通過蛋白質(zhì)譜（enChIP-MS），鑒定與之特異性相互作用的蛋白質(zhì)。這些工具的開發(fā)都極大地幫助了科研人員，使得之前無法實現(xiàn)的操作成為可能，推動了生命科學的快速發(fā)展。

　　4、基因及藥物靶標基因的確定

　　以往基于ZFN或TALENs的基因組編輯技術(shù)，需要針對DNA靶序列設(shè)計蛋白質(zhì)，而CRISPR技術(shù)僅需要根據(jù)不同的靶序列合成相應(yīng)的80nt左右的sgRNA來引導Cas9蛋白對序列進行修飾，這就實現(xiàn)了基因編輯技術(shù)的高通量應(yīng)用。

　　CRISPR全基因組篩選技術(shù)可用于必需基因及藥物靶標基因鑒定。多倫多大學Jason Moffa研究組建立了覆蓋全基因組gRNA庫并在5個細胞系中逐個敲除了1.8萬個基因，最后鑒定出在不同細胞系間保守的1580個必需基因構(gòu)成的“core fitness genes”。同樣，美國達納-法伯癌癥研究所W. Nick Haining研究組通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)性地敲除了黑色素瘤細胞的2368個基因，發(fā)現(xiàn)ptpn2基因缺失會使這些癌細胞對PD-1阻斷更加敏感。華盛頓大學醫(yī)學院Michael Diamond研究組利用CRISPR/Cas9鑒定在宿主細胞中堅定了黃病毒感染所絕對必需的9個基因，其中spcs1基因缺失時，不僅降低黃病毒感染率，而且對細胞也不產(chǎn)生副作用，這將是一個潛在的黃病毒藥物靶標。

　　5、疾病建模及器官供體產(chǎn)生

　　CRISPR/Cas9作為新一代基因編輯技術(shù)，同樣可被應(yīng)用于建立疾病模型及培育供體器官。基因治療可實現(xiàn)在患者自身細胞中糾正遺傳缺陷，并結(jié)合其他生物學技術(shù)在體外培育出組織特異性的“類器官”，對于疾病建模、藥物篩查及臨床治療等方面研究有極大意義。CRISPR介導的基因組編輯技術(shù)可以直接應(yīng)用于非人類哺乳動物的疾病模型建立，將更有利于疾病致病機理和治愈研究。

　　此外，CRISPR技術(shù)還可應(yīng)用于大型動物的基因編輯以研究免疫排斥及跨物種的疾病傳染，從而解決異種移植器官來源的瓶頸，豬被認為是人體異種器官來源的首選動物，而目前豬器官用于人類的主要障礙為免疫排斥反應(yīng)，及豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Porcine endogenous retroviruses，PERVs）帶來的醫(yī)療風險問題。eGenesis公司楊璐菡博士與哈佛大學George Church教授利用CRISPR進行基因改造一步讓62個PERV pol基因關(guān)閉，因而將來自PERV的傳染風險降低了三個數(shù)量級，成功培育出不含PERVs的豬品系，作為安全有效的異種移植器官來源，這些研究讓豬成為病人的器官來源更有前景。

　　6、基因療法

　　基因編輯技術(shù)可以準確地改造人類基因，達到基因治療效果。中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組通過在小鼠胚胎中注射CRISPR/Cas9糾正白內(nèi)障小鼠模型中的遺傳缺陷，所產(chǎn)生的后代是可育的并能將修正后的等位基因傳遞給它們的后代。杜氏肌營養(yǎng)不良（DMD）是一種罕見的肌肉萎縮癥，也是最常見的致命性遺傳病之一，是由肌營養(yǎng)不良蛋白dystrophin基因突變引起。杜克大學Charles Gersbach研究組應(yīng)用CRISPR/Cas9在DMD小鼠中將dystrophin基因突變的23外顯子剪切，而合成了一個截短的但功能很強的抗肌萎縮蛋白，這是生物學家“首次成功地利用CRISPR基因編輯技術(shù)治愈了一只成年活體哺乳動物的遺傳疾病”。

　　基因編輯技術(shù)聯(lián)合免疫療法在腫瘤及HIV/AIDS治療具有廣泛的應(yīng)用前景。嵌合抗原受體T細胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）細胞治療是非常有前景的腫瘤治療方法。CAR-T細胞療法在B細胞惡性血液腫瘤治療中已經(jīng)取得碩果。中科院動物研究所王皓毅研究組利用CRISPR/Cas9技術(shù)在CAR-T細胞中進行雙基因（TCRα subunit constant 和beta-2 microglobulin）或三基因（TRAC，B2M及programmed death-1）敲除。美國斯隆凱特林癌癥紀念中心Michel Sadelain研究組發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9技術(shù)將CAR基因特異性靶向插入到細胞的TRAC基因座位點，極大增強了T細胞效力，編輯的細胞大大優(yōu)于傳統(tǒng)在急性淋巴細胞白血病小鼠模型中產(chǎn)生CAR-T細胞。

　　繼諾華的Kymriah以及Gilead（kite Pharma）的Yescarta接連上市，CRISPR Therapeutics公司也在應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)開發(fā)同種異體CAR-T候選產(chǎn)品。2016年10月，四川大學華西醫(yī)院的腫瘤醫(yī)生盧鈾領(lǐng)導的一個團隊首次在人體中開展CRISPR試驗，從晚期非小細胞肺癌患者體內(nèi)提取出免疫細胞，再利用CRISPR/Cas9技術(shù)剔除細胞中的PD-1基因更有助于激活T細胞去攻擊腫瘤細胞，最后將基因編輯過的細胞重新注入患者體內(nèi)。

　　7、致病菌及抗病毒研究

　　微生物種群與人體醫(yī)學，自然環(huán)境息息相關(guān)。北卡羅來納大學Rodolphe Barrangou與Chase L. Beisel合作通過使用基因組靶向CRISPR/Cas9系統(tǒng)可靶向并區(qū)分高度密切相關(guān)的微生物，并程序性去除細菌菌株，意味著CRISPR/Cas9系統(tǒng)可開發(fā)成精細微生物治療體系來剔除有害致病菌，人類將有可能精確控制微生物群體的組成。以色列特拉維夫大學Udi Qimron將CRISPR系統(tǒng)導入溫和噬菌體中在侵染具有抗生素抗性的細菌以消滅此類細菌，CRISPR系統(tǒng)已具有成為新一類抗生素的潛力。Locus BioSciences公司也在開發(fā)在噬菌體中開發(fā)CRISPR系統(tǒng)以達消滅難辨梭菌的目的。

　　弗吉尼亞理工大學Zhijian Tu研究組在雄蚊子中進行M因子基因編輯，可以導致雌雄蚊之間的轉(zhuǎn)化或雌蚊的殺戮，從而實現(xiàn)有效的性別分離和有效減少蚊子的數(shù)量，也將減少寨卡病毒及瘧疾等傳播。

　　基于CRISPR治療不僅可以應(yīng)用于根除共生菌或有益菌群的病原體，也可應(yīng)用于靶向人類病毒，包括HIV-1，皰疹病毒，乳頭瘤病毒及乙型肝炎病毒等。具有純合的32-bp缺失（Δ32）的CC趨化因子受體5型（CCR5）基因的患者對HIV感染具有抗性。因此加利福尼亞大學Yuet Wai Kan在誘導多能干細胞iPSC中利用CRISPR系統(tǒng)引入純合CCR5Δ32突變后，誘導分化后的單核細胞和巨噬細胞對HIV感染具有抗性。天普大學Kamel Khalili 課題組應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在宿主細胞基因組中精確編輯HIV-1 LTR U3區(qū)，從而在將艾滋病病毒從基因組中剔除。

　　8、核酸診斷及細胞事件記錄

　　Cas12a（Cpf1）屬于CRISPR家族另一核酸內(nèi)切酶，它也可被gRNA引導并剪切DNA。但是，它不僅可以切割相結(jié)合的單鏈或雙鏈DNA，也剪切其他的DNA。近日，加州大學伯克利分校Jennifer Doudna研究組開發(fā)了基于CRISPR的一項新技能——基因偵探（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter （DETECTR）。利用單鏈DNA將熒光分子和淬滅分子連接構(gòu)建成一個報告系統(tǒng)，當CRISPR-Cas12a在gRNA引導下結(jié)合到目標DNA并發(fā)揮剪切作用時，報告系統(tǒng)中的DNA也被剪切，熒光分子將被解除抑制。此系統(tǒng)在致癌性HPV的人的DNA樣品檢測HPV16和HPV18變現(xiàn)極佳。

　　布羅德研究所Feng Zhang研究組開發(fā)的基于CRISPR的2代SHERLOCK （Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），原理是利用Cas13a被激活后，可以切割除靶序列外其他的RNA的特征，引入了解除熒光分子的抑制。此工具可實現(xiàn)一次性多重核酸檢測，可同時檢測4種靶標分子，額外添加的Csm6使得這種工具比它的前身具有更高的靈敏度，并將它開發(fā)成微型試紙條檢測方法，簡單明了易操作，已被研究人員成功應(yīng)用于RNA病毒，如登革熱病毒和寨卡病毒，及人體液樣本檢測。

　　Broad研究所David R. Liu研究組利用CRISPR/Cas9開發(fā)了一種被稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的記錄細胞事件的“黑匣子”他們利用這個系統(tǒng)開發(fā)出兩種細胞記錄系統(tǒng)，在第一種被稱為“CAMERA 1”的細胞記錄系統(tǒng)中，研究人員利用細菌中質(zhì)粒的自我復制但又嚴格控制其自身數(shù)量的特征，將兩種彼此之間略有不同的質(zhì)粒以穩(wěn)定的比例轉(zhuǎn)化到細菌中，隨后在接觸到外來藥物刺激時，利用CRISPR/Cas9對這兩種質(zhì)粒中的一種進行切割，通過對質(zhì)粒進行測序并記錄兩種質(zhì)粒比例的變化來記錄細菌接觸外來刺激的時間。另一種細胞記錄系統(tǒng)被稱為“CAMERA 2”，它利用基于CRISPR/Cas9的堿基編輯系統(tǒng)實現(xiàn)在細胞內(nèi)特定信號發(fā)生時改變遺傳序列中的單個堿基，以此實現(xiàn)對諸如感染病毒、接觸營養(yǎng)物等刺激的記錄。這套技術(shù)的出現(xiàn)將很大程度的幫助人們進一步了解細胞的各類生命活動的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。

　　9、人類胚胎基因組編輯

　　2015年4月，中山大學的黃軍利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術(shù)，同源重組修復了胚胎中一個引發(fā)地中海貧血β-globin gene（HBB）的突變。

　　2016年，廣州醫(yī)科大學的范勇團隊在三原核受精卵中，應(yīng)用基因編輯技術(shù)CRISPR受精卵中的基因CCR5進行編輯引入CCR5Δ32純合突變由于當時脫靶效率問題突出，產(chǎn)生了鑲嵌式的受精卵。

　　2017年8月2日，俄勒岡健康與科學大學胚胎細胞和基因治療中心Shoukhrat Mitalipov研究組公布了其應(yīng)用CRISPR在人類胚胎中進行DNA編輯的結(jié)果，糾正了突變的MYBPC3基因，其突變會引起心肌肥厚并將年輕運動員猝死。

來源：億歐